Cyclin D1 的 WB 用 1/25

Cyclin D1 兔单抗，IHC-P 1/100

做血清饥饿同步化，G1 期收样跑 Cyclin D1。条带过曝成一片黑，背景也不干净。

一直用 1/1000，这次怀疑是上样量太大。翻说明书，WB 那一栏写的是 1/25 到 1/200。

差了四十倍。这支的 WB 推荐浓度比常规一抗高得多，按习惯配就会过曝。

核蛋白要单独提

Cyclin D1 是核蛋白，跟 CDK4/6 结合后进核，推动 G1 到 S 的转换。

全细胞裂解液里，核蛋白占比不高，跑出来容易弱。用核质分离试剂盒单独提核，信号会清楚很多，杂带也少。

提取的时候注意别把核丢在沉淀里。超声强度不够，核没破，目标蛋白留在沉淀，上清跑出来是空的。

核质分离之后，胞质那部分别扔。有些样本里 Cyclin D1 在胞质也有分布，两条线一起看能解释总裂解液的差异。

这支的事实

克隆号 SP4，兔单抗，IgG。反应种属写了人、小鼠、大鼠三个。

应用四项，WB、IHC、FCM、IF/ICC。这支从杂交瘤切换到重组生产，说明书里注明了切换时间。

稀释给得很细。IHC-P 1/100，WB 1/25 到 1/200，ICC/IF 1/50 到 1/250，胞内流式 1/30。

流式 1/30 这个浓度也不低。做胞内染色时，固定破膜之后抗体容易进得多，浓度得压。

IHC 的条件写得很细

石蜡切片的流程给到了每一步。脱蜡用二甲苯或者替代试剂加梯度酒精，修复用 10 mM 柠檬酸 pH 6.0 煮沸十分钟，室温冷却二十分钟。

一抗孵育写的是室温三十分钟。这个时间比常规的过夜孵育短，配套的是 1/100 的浓度。

每一步之间都要洗，PBS 加 0.05% Tween。这几句看着琐碎，实际是整套流程能被复现的关键。

按这个走，别自作主张改成四度过夜。浓度和时间是配好的，改一头就得改另一头。

按这个流程走，一个工作日能出片，比过夜孵育省一天。

三条操作建议

WB 从 1/100 起，不要一上来就 1/25。除非样本里 Cyclin D1 极低，否则 1/25 大概率过曝。

做细胞周期实验，收样时间点要卡准。G1 期同步化释放后，Cyclin D1 的窗口很窄，收晚了就进 S 期了。

IHC 判读看核。胞质有淡染不算阳性，核染成棕色才算。

对照组也要跑。同步化没做好，G1 期比例不够，Cyclin D1 本来就不高，条带弱不能算抗体的问题。

下次配一抗，把这支的 1/25 单独写一张标签贴在管子上，别跟其他一抗混在一个盒子里按 1/1000 配。

关键参数

反应种属	Human, Mouse, Rat
抗原名称	CCND1
验证应用	WB, IHC, FCM, IF/ICC
宿主/亚型	Rabbit / IgG
抗体类型	Monoclonal
纯化方式	Affinity purification Protein A
推荐稀释	IHC-P 1/100 Deparaffinization: Deparaffinize slides using xylene or xylene alternative and graded alcohols. Antigen Retrieval: Boil tissue section in 10mM citrate buffer, pH 6.0 for 10 min followed by cooling at room temperature for 20 min. Primary Antibody Incubation: Incubate for 30 minutes at room temperature. Slide Washing: Slides must be washed in between steps. Rinse slides with PBS/0.05% Tween. Perform heat-mediated antigen retrieval with citrate buffer pH 6 before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/25 - 1/200；ICC/IF 1/50 - 1/250；Flow Cyt (Intra) 1/30
储存条件	短期 +4°C；长期 -20°C

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