不加 LPS，iNOS 就是空白

兔单抗，WB 1/1000，需 LPS 诱导

RAW264.7 传到第六孔，裂解，跑胶，iNOS 那个位置什么都没有。

换了一支新抗体，还是没有。第三次数了细胞，确认没接错。

问题在刺激。静息状态的巨噬细胞几乎不表达 iNOS，产品页在三个应用的稀释说明里都写了一句，检测 iNOS 需要用 0.1 到 1 µg/ml 的 LPS 处理细胞。

诱导型的意思就是不诱导没有

一氧化氮合酶有三个成员，神经元型和内皮型是钙依赖的，常驻表达。iNOS 不一样，它在转录水平上被调控。

细菌产物、炎症因子上去，启动子打开，酶才被做出来。没有刺激，蛋白量低到 WB 看不见。

所以做这批样本，第一件事不是选抗体，是确认刺激方案。LPS 浓度、作用时间、细胞状态，任何一个不对，后面全是白跑。

iNOS 催化的是 L-精氨酸到一氧化氮的反应，产物半衰期短。做功能实验时通常还要测培养上清里亚硝酸盐的累积量，两个结果对着看。

这支的事实

兔单抗，克隆号 EPR16635，IgG，无标记，Protein A 亲和纯化。

种属写了人、小鼠、大鼠。应用列了 WB、ELISA、IF/ICC、IP 四项。

稀释比给得齐。WB 1/1000，ICC/IF 1/500，IP 1/100。三个数字后面都跟着同一句提示，检测前需要 LPS 处理。

产品页把它归在 IHC 类别，应用列表里却没有 IHC，做切片前先自己验证一遍。

缓冲液是 PBS 加 40% 甘油和 0.05% BSA，含 0.01% 叠氮钠。甘油比例高，-20°C 不会冻实，取用前离心一下。

刺激条件怎么定

LPS 从 0.1 µg/ml 起，做一个 0.1、0.5、1 的梯度，各做 6 小时和 12 小时两个时间点。

不同批次的血清内毒素水平不一样，全部实验用同一批血清，组间才有可比性。

判断标准不是条带越深越好。要找的是背景干净、条带单一的那一档，信号过饱和以后定量就不准了。

同一批实验留一孔不加 LPS 做阴性对照。没有这一孔，阳性结果说服力不够。

细胞密度也影响结果。铺得太稀的孔，刺激后信号普遍偏弱，按七成汇合起铺。

IF 做胞内染色时，刺激后先洗掉 LPS 再固定，残留的细菌产物会影响封闭效果。

三条操作建议

WB 上样量给到 30 µg，iNOS 诱导后的表达量个体差异大。

IP 用 1/100，裂解液里加 1 mM PMSF，诱导后的细胞蛋白酶活性高。

产品页没有列流式应用，要做流式得自己先验证。

下次种板，把加 LPS 和不加的分两板，别放同一个皿里。

关键参数

反应种属	Human, Mouse, Rat
抗原名称	NOS2
验证应用	WB, ELISA, IF/ICC, IP
宿主/亚型	Rabbit / IgG
抗体类型	Monoclonal
纯化方式	Affinity purification Protein A
推荐稀释	WB 1/1000 To detect iNOS expression, macrophages need to be treated with LPS (0.1 - 1 ug/ml).；ICC/IF 1/500 To detect iNOS expression, macrophages need to be treated with LPS (0.1 - 1 ug/ml).；IP 1/100 To detect iNOS expression, macrophages need to be treated with LPS (0.1 - 1 ug/ml).
储存条件	短期 +4°C；长期 -20°C

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品牌	货号	品名
Abcam	Ab178945	Anti-iNOS antibody [EPR16635] 本文产品
Abcam	Ab15323	Anti-iNOS antibody
Abcam	Ab3523	Anti-iNOS antibody
Abcam	Ab283655	Anti-iNOS antibody [RM1017]

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