封闭用奶粉，pAKT 就糊了
兔单抗，WB 1/5000 起，推荐 BSA 封闭
胰岛素刺激十分钟，收样，跑胶，pAKT 那条带周围一片灰。
加了磷酸酶抑制剂，换了新的一抗，灰还在。
产品页的 WB 说明里有一句提示，建议用 BSA 做封闭。脱脂奶粉里的酪蛋白是磷酸蛋白，封闭液本身就在跟磷酸化抗体抢结合位点。
磷酸化抗体的背景从哪来
磷酸化抗体的靶点是一个小小的磷酸基团，识别靠的是磷酸基团加上周围几个残基。
封闭蛋白如果本身被磷酸化，抗体会分一部分去结合它。奶粉里酪蛋白的磷酸化程度高，这种情况在 pAKT 这类信号偏弱的靶点上特别明显。
另一部分背景来自样本。血清刺激后磷酸化水平升得快、降得也快，收样慢一点，信号就掉一半。
S473 由 mTORC2 负责磷酸化，T308 由 PDK1 负责，两个位点常一起看。只测 S473，拿到的是其中一半的信息。
这支的事实
兔单抗，克隆号 EP2109Y，IgG，无标记，Protein A 纯化。靶点是 AKT1 的 S473 磷酸化位点。
种属写了人、小鼠、大鼠，另外验证过重组片段样本。
应用列了 WB、IHC、Dot blot 和 In-Cell ELISA。稀释比给得细，WB 1/5000 到 1/10000，IHC-P 1/100 到 1/250，Dot 1/1000。
产品页注明的样本类型里包含重组片段，做纯化蛋白的 Dot blot 时上样量按摩尔数算更准。
IHC 需要热修复。缓冲液含 40% 甘油和 0.05% BSA，pH 7.2 到 7.4。
定量的边界
WB 稀释比到 1/10000 这个量级，说明效价高，一支能用很久。
但磷酸化 WB 做定量，本身有天花板。曝光到饱和以后，条带深浅跟蛋白量不再成正比。
做处理组和对照组的比较，两块胶要同一天跑、同一批试剂、同一曝光时间。分开跑的两块胶，数字不能直接比。
Dot blot 给的是 1/1000，比 WB 浓十倍。做 Dot 的时候上样体积要小，点样量大了会洇开。
膜的类型也影响结果。硝酸纤维素膜和 PVDF 对蛋白的吸附不一样，两批实验换膜，点样量要重新定。
三条操作建议
封闭液换 5% BSA，TBST 配，室温一小时。一抗二抗都用 BSA 稀释。
刺激后立刻加冰 PBS 洗一遍，裂解液里磷酸酶抑制剂现加，煮样前不要放冰上超过二十分钟。
IHC 修复用 EDTA pH 9.0，微波十五分钟，磷酸化表位对修复条件敏感，修复不足染不出来。
下次做时间梯度，0、5、10、30 分钟各一管，一起跑一块胶。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | AKT1 phospho S473 |
| 验证应用 | WB, IHC, ELISA, Dot |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/100 - 1/250 Perform heat-mediated antigen retrieval before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/5000 - 1/10000 Abcam recommends using BSA as the blocking agent.；Dot 1/1000 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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