内参跑不齐，先看归一化
兔单抗，42 kDa，五项应用
六孔板收蛋白，BCA 定量，每孔上 20 µg，跑完 actin 一看，条带深浅差了将近一倍。
定量重做了一遍，还是差。
问题在裂解。贴壁细胞刮下来的时候，有的孔刮得干净，有的孔留了一层。定量的数值是平均，跑出来的条带是实情。
上样对照能说明什么
actin 是细胞骨架的主要成分，表达量在多数细胞类型里稳定。
用它做上样对照，看的是每个泳道的总蛋白量是否一致。
actin 有几个亚型，这支认的是 ACTA1，骨骼肌样本信号强，成纤维细胞里弱一些。
它不能证明目的蛋白的变化是真实的，只能排除上样量这个变量。目的蛋白的结论，还得靠重复实验和定量。
这支的事实
兔单抗，克隆号 EPR16769，IgG，无标记。产品页标注分子量 42 kDa。
种属写了人、小鼠、大鼠、鸡四个。应用列了 WB、IHC-P、FCM、IF/ICC、IP 五项。
稀释比给得细。WB 1/5000，IHC-P 1/500 到 1/1000，ICC/IF 1/50，流式胞内 1/70，IP 1/40。
同一支抗体，ICC 要给到 1/50，比其他应用浓两个数量级。做细胞骨架染色，浓度不够会只看到弥散的胞质背景。
IHC 用 Tris/EDTA pH 9.0 修复。
一支抗体四种用法
做 WB，它是最常见的上样对照，1/5000 一支能用很久。
做 ICC，1/50，能看到应力纤维和皮层骨架，形态清楚。
流式胞内 1/70，固定破膜后胞质信号很强，门要往前设，不然阳性群贴边。
做免疫沉淀，1/40，拉下来的复合物里除了 actin 还有结合蛋白。
做 IHC，1/500 到 1/1000，组织里的肌纤维和上皮都能染。
冰冻切片产品页没给单独条件，按 IHC-P 的稀释比往上调一档再试。
这几种用法的最优条件不通用，每个都要单独摸。
三条操作建议
裂解前用 PBS 洗两遍，刮的时候同一个方向，刮完立刻冰上。
同一支抗体在 ICC 上给到 1/50，比 WB 浓一百倍，两个实验的用量分开算。
定量后按最低浓度的那一管调平，不要往高浓度那管里加水稀释，稀释会改变缓冲液成分。
裂解液里加蛋白酶抑制剂，actin 被降解时条带下移，容易被误判成上样不齐。
WB 跑 10% 胶，42 kDa 在中间位置，前后留出空间看有没有降解带。
做 WB 前把胶洗干净，42 kDa 附近有胶条残渣会看成杂带。
下次种板，六个孔用同一批细胞、同一个传代次数，孔间差异会小很多。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat, Chicken |
| 抗原名称 | ACTA1 |
| 验证应用 | WB, IHC, FCM, IF/ICC, IP |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/500 - 1/1000 Perform heat-mediated antigen retrieval with Tris/EDTA buffer pH 9.0 before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/5000；ICC/IF 1/50；Flow Cyt (Intra) 1/70 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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