凋亡诱导 6 小时，剪切带可能还没出来

Anti-Cleaved Caspase-3，兔多抗，WB 验证

药物处理 6 小时，收蛋白，跑胶。caspase-3 的全长带很清楚，剪切带几乎看不见。

你把曝光时间拉到最长，背景全出来了，17 kDa 的位置还是空。

凋亡是个过程，剪切带的出现有时间窗。

剪切带的出现顺序

caspase-3 被上游的 caspase 切开，去掉 prodomain，形成 17 和 19 kDa 的片段。

这个剪切发生在凋亡早期，但比上游的 caspase 活化晚。

不同细胞、不同诱导方式，时间窗差别很大。有的细胞四小时就出来，有的要到二十四小时。

一开始就选 6 小时，很容易落在窗外面。

先做梯度再定时间，这一步省不了。

梯度不用密，四个点足够看出趋势。

这支抗体的参数

Ab2302 是兔多克隆，靶点 CASP3，反应种属只写了人。

验证应用只有 WB。

产品页没有给推荐的稀释比，这个要自己摸。

只做人、只做 WB，这两条限制在动手之前就要确认。小鼠样本不在范围内，IHC 也不在这支抗体的验证列表里。

做小鼠模型的实验室，选型时可以直接跳过这支。

种属不对的抗体，膜上既不出目的带也不出杂带，看起来像样本不表达。

遇到这种情况先翻说明书，再回头查样本，顺序别反。

时间点和对照

做时间梯度，4、8、12、24 小时各收一次。先看剪切带什么时候出现，再定正式实验的点。

阳性对照用已知能诱导凋亡的处理，同一块膜上跑。

阴性对照用未处理的细胞，确认基础水平。基础水平高，先查培养状态，不是抗体的问题。

阳性对照的强度也要看。对照太强，相邻泳道的信号会被压掉。

对照可以少上一点样，弱一些反而好用。

判断上的事

剪切带弱，不代表凋亡没发生。

凋亡细胞在群体里比例低，混在活细胞里，WB 测的是平均值。流式或者 Annexin V 能给比例，WB 只能给有没有。

两个方法一起做，结论会稳一些。

流式做 Annexin V 和 PI 双染，能把早期和晚期分开，比单染有信息量。

双染的门控要先用单阳管调，补偿没做好，比例全是错的。

曝光时间不要拉到背景发灰。剪切带本来就弱，背景一高就分不清，量化时更没法比。

上样量可以适当加大，但要先确认目的条带没有过载。

过载的条带中间发白，定量读出来是偏低的值。上样前先跑一张预实验胶，把量定下来。

下一次做凋亡，先跑一条 4 到 24 小时的梯度，把剪切带出现的时间定下来。

关键参数

反应种属	Human
抗原名称	CASP3
验证应用	WB
宿主/亚型	Rabbit / IgG
抗体类型	Polyclonal
纯化方式	Affinity purification Immunogen
储存条件	短期 +4°C；长期 -20°C

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品牌	货号	品名
Abcam	AB2302	Anti-Cleaved Caspase-3 antibody 本文产品
Abcam	Ab32042	Anti-Cleaved Caspase-3 antibody [E83-77]
Abcam	Ab214430	Anti-Cleaved Caspase-3 antibody [EPR21032]
Abcam	Ab32064	Anti-Cleaved PARP1 antibody [E51]

参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。