ChIP 的抗体量，跟着染色质走
H3K27me3 单抗，25 µg 染色质配 5 到 10 µg
超声完的染色质先测浓度，1.2 µg/µL，取 20 µL 就是 24 µg。
按这个量算抗体，表观组那台冰箱里翻出一支旧管，按经验加了 2 µg。
IP 完 qPCR 跑出来，阳性位点的富集不到 IgG 对照的两倍。
他们把原因归到超声片段太大，重新做了一遍，结果一样。
用量写的是绝对值
产品页给 ChIP 的条件是 25 µg 染色质配 5 到 10 µg 抗体，单位是微克，不是稀释比。
绝对值写法的好处是不用管抗体原液的浓度。坏处是染色质定量必须准，量少了抗体就过量，背景跟着上来。
按 5 到 10 µg 一次算，一支抗体能做的次数有限。这个账要在开做之前算，不然做到一半断货。
2 µg 对 25 µg 染色质，比例是偏低的，富集上不去是正常结果。
阳性对照有现成的引物
产品页点名 ab269261 这对 Myo-D 引物可以做阳性对照。
ChIP 失败的时候，第一步是分清抗体的问题还是样本的问题。阳性引物扩不出来，问题在抗体或染色质；阳性扩得出来，阴性位点也干净，才轮到怀疑目标位点本身。
阴性对照用 IgG，同宿主同亚型最理想。这支是小鼠 IgG3，IgG3 在多数组织里表达量低，做对照正好。
超声之后跑一次琼脂糖，片段集中在 200 到 500 bp 再做 IP，能省掉一半重复。
这支抗体的其他系统
同一支还能做 ICC/IF、ELISA 和 IHC。
ICC/IF 给 5 µg/mL，和 ChIP 的量完全不是一回事，不要互相推。ELISA 的区间是 0.025 到 1 µg/mL，跨度大，做标准曲线的时候要自己摸。
IHC 用在石蜡切片上，H3K27me3 的阳性在核内，染色偏细颗粒，不是均匀一片。
H3K27me3 在核内的分布不是均匀的，被沉默的区域会聚成一个个亮点。低倍看整片核的亮度，高倍看点状结构的数量，两级的判读标准要提前定下来。
多克隆和单克隆在这类修饰抗体上的差别，主要体现在批间一致性上。这支是单克隆，亚型 IgG3，好处是同一批号之间波动小，坏处是换批之后要重新确认一遍。
染色质的质量比抗体量更值得花时间。同一份裂解液，超声条件不同，IP 的富集能差好几倍。
一个靶点三套系统，记录的时候分栏写，别写在同一格里。
明天先做两件事
染色质定量做三个复孔，取平均值，按 25 µg 一管分装冻起来。
抗体按 5 µg 起，做一组 5 µg 和一组 10 µg，阳性引物和阴性位点一起跑。
如果两组富集都在两倍以下，先查超声，不要继续加抗体量。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Bovine |
| 抗原名称 | H3C1 tri methyl K27 |
| 验证应用 | IHC, ELISA, IF/ICC, ChIP |
| 宿主/亚型 | Mouse / IgG3 |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | ICC/IF 5 µg/mL；ChIP 5-10 µg for 25 µg chromatin Use Myo-D ChIP primer pair ab269261 as positive control.；ELISA 0.025-1 µg/mL |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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