Iba1 封闭用脱脂奶，别用 BSA
Anti-Iba1 [EPR16588]，兔单抗，IHC 1/2000
小胶质细胞的形态学，做的人都知道要靠突起。片子染出来只剩胞体，突起全糊在背景里。
同学把一抗从 1/500 稀释到 1/2000，突起清楚了一些，背景还在。
她用的封闭液是 5% BSA，一直是这个配方。
产品页上写着另一句话，WB 建议用 3% 脱脂奶封闭，用 BSA 背景会略高。
一支抗体，五种条件
这支抗体的验证系统铺得很开，WB、IHC-P、ICC/IF、流式胞内、冰冻切片都做了。
条件各不同。WB 1/500 到 1/2000，IHC-P 1/2000，ICC/IF 0.1 到 1 µg/mL，流式 1/160，IHC-Fr 1/200。
石蜡和冰冻的差别最大，一个 1/2000，一个 1/200。石蜡切片经过热修复，表位暴露得充分，抗体可以给得很稀；冰冻切片没经过修复，浓度要高一个数量级。
这两个数放在一起看，就知道为什么不能拿石蜡的条件直接做冰冻。
流式的 1/160 又是另一套逻辑。胞内染色要先固定再破膜，细胞悬在管里，抗体扩散快，浓度不需要像切片那样高。
封闭液不是随便选的
脱脂奶里有酪蛋白，是一堆磷酸化蛋白和糖蛋白的混合物，能占掉不少非特异的结合位点。
BSA 成分单一，干净，但对某些抗体来说占位不够，背景就压不住。
产品页明确写了这支抗体在 BSA 封闭下背景略高，这种提示比通用配方更有用。
换封闭液的时候一次只改这一个变量，其他步骤锁死，否则出了问题分不清是哪一步。
小胶质细胞的判读
静息态的小胶质细胞胞体小，突起细长，分支多。激活之后胞体变大，突起变粗变短。
Iba1 染的是胞质，膜和突起都能着上色。判读先看突起的分支层次，再看胞体大小。
背景重的时候，突起最先消失。这时候先解决背景，别急着判定细胞状态。
计数的话，固定几个视野，按同一阈值二值化，别一张一张手调。
计数还要看切片厚度。石蜡切片四微米，冰冻切片常常二十微米，同一视野里的细胞数差好几倍，两组数据不要混着比。
三条今天能改的
WB 换 3% 脱脂奶封闭，室温一小时，其他条件不动。
IHC-P 用 1/2000，Tris/EDTA pH 9.0 做热修复，修复不到位的话，1/2000 是染不出来的。
冰冻切片单独走一套，从 1/200 起，不要沿用石蜡的稀释比。
下一批片子，一半用奶封闭一半用 BSA，同一张玻片上放两张相邻切片，第二天看突起的分支是不是回来了。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | AIF1 |
| 验证应用 | WB, IHC, FCM, IF/ICC |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/2000 Perform heat-mediated antigen retrieval with Tris/EDTA buffer pH 9.0 before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/500 - 1/2000 Abcam recommends blocking in 3% milk for cleanest results in WB. Blocking with BSA gives slightly higher background.；ICC/IF 0.1-1 µg/mL；Flow Cyt (Intra) 1/160 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。