Nrf2 的条带，取决于收样时间
Anti-Nrf2 [EP1808Y]，WB 1/200 起
用氧化剂处理细胞，做了六个时间点，想看到 Nrf2 在核里积累。结果六个点的条带一样深，看不出诱导。
细胞是对的，抗体是对的。收样的顺序错了。
Nrf2 在正常状态下一直在被降解
Nrf2 由 NFE2L2 编码，是一个 bZIP 家族的转录因子，结合抗氧化反应元件，启动下游一批解毒酶和抗氧化酶的表达。
没有应激的时候，Keap1 把它扣在胞质里，同时持续送去做泛素化降解。半衰期很短，通常以分钟计。
这个设计让细胞能快速响应。氧化应激一来，Keap1 上的半胱氨酸被修饰，构象变了，Nrf2 不再被降解，新合成的蛋白迅速积累，往核里转。
处理之后的时间窗很窄。诱导起效在两小时上下，四到六小时可能就到峰值，往后开始回落。
收样要快，也看稀释比
从培养箱拿出来到加裂解液，中间每一步都在消耗 Nrf2。
培养基倒掉之后直接加预冷的裂解液，不要先用 PBS 洗两遍。洗的过程有几分钟，这几分钟足够让一部分 Nrf2 被降解。
裂解液里加蛋白酶抑制剂，新鲜配。冻融过的抑制剂 cocktail 效果会掉。
如果目标是看核内积累，做核浆分离。全细胞裂解液里，核内的那部分信号会被胞质的基线盖住，看不出转位。
WB 给的是 1/200 到 1/1000，ICC/IF 是 1/1000 到 1/5000，流式胞内 1/40。
IF 的浓度比 WB 低，因为细胞样本的抗体用量小，背景容易压。流式的 1/40 看起来高，实际是破膜后的样本，非特异吸附多，浓度低了分不开群。
产品页还写了一句，建议根据样本类型优化抗体浓度。这句不是客套，Nrf2 在不同细胞里的丰度差别很大。
反应种属只写了人。做小鼠和大鼠的样本，这支要自己验证。
核染色的判读
ICC/IF 看的是核内的信号。正常的细胞里，Nrf2 主要在胞质，核内弱。诱导之后，核内变亮，胞质相对减弱。
判断的时候和核染料比重合度。重合度高，且核内的信号比胞质强，才算转位。
只看核变亮不看胞质，容易把整体表达上调当成转位。两个区室的比值才是判据。
三条操作建议
时间点密一点。零、一、二、四、六、八小时，六个点起步。间隔太宽，峰值会漏掉。
每个时间点单独一管，同时收，不要一个点一个点处理。批次之间的处理差异会盖过时间效应。
WB 上样量按总蛋白算，跑完先看内参。Nrf2 的诱导幅度有限，内参不齐的时候，结论站不住。
下次做这组实验，把裂解液先预冷摆好，培养箱门开着，一管一管往外拿。
关键参数
| 反应种属 | Human |
| 抗原名称 | Nfe2l2 |
| 验证应用 | WB, FCM, IF/ICC |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | WB 1/200 - 1/1000；ICC/IF 1/1000 - 1/5000；Flow Cyt (Intra) 1/40 We recommend to optimize the antibody concentration according to the different sample type. |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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