总 AKT 和 pAKT 别混着用
兔多抗，免疫原覆盖 1 到 224 位
抑制剂处理 24 小时，收蛋白，跑 pAKT，信号掉得很干净，结论是通路被压住了。
审稿意见回来问了一句，总 AKT 有没有变。
补跑总 AKT 才发现，处理组的条带也浅了一截。磷酸化比例没怎么动，蛋白总量掉了。这个区别用一支只认磷酸化的抗体看不出来。
总蛋白和磷酸化蛋白测的不是一件事
磷酸化抗体读的是修饰状态，总蛋白抗体读的是蛋白量。
信号变弱，可能是激酶活性被压住，也可能是蛋白被降解、细胞数量减少、上样量不均。这几种情况在磷酸化 WB 上长得一样。
所以做通路实验，标准配置是一支磷酸化抗体加一支总蛋白抗体，同一批样本两块膜并排跑。比例才算得出来。
同一块膜跑还有个好处，上样量的偏差能被内参校正，处理组和对照组的比值可以直接算。
这支的事实
兔多抗，IgG，未偶联，抗原亲和纯化。缓冲液是 PBS 加 0.02% 叠氮钠和 50% 甘油，pH 7.3。
免疫原是重组人 AKT，大肠杆菌表达，GST 标签，覆盖 1 到 224 位。这一段包含 PH 结构域和激酶结构域的前半。
种属写了人、小鼠、大鼠。应用列了 WB、ELISA、IF/ICC、IP 四项。
产品页给了 RRID。-20°C 保存，到货后一年内稳定，产品页注明这个温度下不必分装。
产品页没有给稀释比，这一点做定量时要自己定，别照抄别的货号。
多抗在总蛋白检测上的意义
AKT 有几个亚型，序列高度相似。多抗识别多个表位，通常能同时认出这几种，做总 AKT 反而合适。
免疫原取的是 1 到 224 位，避开了 C 端调节区，做总蛋白检测不受 C 端修饰影响。
代价还是背景。血清饥饿的样本里 AKT 总量低，多抗在这种样本上容易出杂带。
产品页提到 AKT1 在血清饥饿的成纤维细胞里处于催化失活状态，激活靠生长因子，快而且特异。做刺激实验，血清饥饿是前置步骤，别省。
做免疫沉淀时目标丰度低，起始裂解液给到 1 毫克总蛋白，拉下来的量才够跑胶。
三条操作建议
总 AKT 和 pAKT 用同一批裂解液、同一块胶，跑完分别孵育，比例才有意义。
做 IP 前先跑一次 WB 看裂解液里 AKT 的量，量不够就加大起始体积。
IF 做胞内定位，固定用 4% 多聚甲醛，透化用 0.1% Triton，AKT 在胞质和膜上都有分布。
IP 拉 AKT 看相互作用，裂解液用 1% NP-40，盐 150 mM，别用 SDS。
下次做抑制剂实验，把总蛋白那条膜一起跑，别只交磷酸化的图。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | AKT1 |
| 验证应用 | WB, ELISA, IF/ICC, IP |
| 偶联标记 | Unconjugated |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Antigen affinity purification |
| 储存条件 | Store at -20°C. Stable for one year after shipment. Aliquoti |
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