一支抗体，两条通路都亮
兔单抗，覆盖 BMP 与 TGF-β 两个分支
BMP4 处理半小时，细胞固定，做磷酸化 SMAD 免疫荧光，核里亮得很整齐。
同一批细胞换成 TGF-β1 处理，用同一支抗体，核里也亮。
这才注意到产品名写的是四个磷酸化 SMAD 一起认。做交叉对话的实验，一支抗体能同时读出两条支路，但两条支路在数据里分不开。
两条支路的区别在哪儿
TGF-β 家族的配体分成两组，一组走 SMAD2/3，一组走 SMAD1/5/9。
两组的下游响应完全不同。SMAD2/3 常跟纤维化、生长抑制挂钩，SMAD1/5/9 多跟成骨、增殖相关。
这两条支路之间有抑制性的交叉，一支被激活时，另一支常被压住。做这个题目，同时读出两个信号是刚需。
问题是同一管抗体把四个磷酸化位点一起认了，WB 上就是一条带，分不出是哪个 SMAD 被磷酸化。
这支的事实
兔单抗，克隆号 EP823Y，IgG，无标记，Protein A 纯化。
靶点写的是 SMAD3 pS423/425，产品名里另列了 SMAD5 和 SMAD1 的 pS463/465、SMAD2 的 pS465/467。四个位点在同一条抗体上。
种属写了人、小鼠。应用列了 WB、IHC、IF/ICC、CUT&RUN-seq 和 Dot blot 五项。
稀释比给得齐，WB 1/2000，IHC-P 1/100 到 1/250，ICC/IF 1/100 到 1/250，Dot 1/1000。
IHC 用 Tris/EDTA pH 9.0 修复，二抗指定用兔源聚合物检测试剂盒。
怎么把两条支路分开
靠刺激条件。只加 BMP4 不加 TGF-β1，看到的信号归到 SMAD1/5/9；反过来归到 SMAD2/3。
加通路特异的抑制剂做反向验证。抑制剂压下去的那一支，就是抗体读到的那一支。
想更细，把这支和单亚型的抗体并排跑，同一块膜上两条线对着看。
做 Dot blot 时 1/1000 够用，点样体积控制在 1 到 2 微升，量大了会洇开。
CUT&RUN-seq 是这支的加分项。做染色质结合，抗体要能在非变性条件下认出磷酸化表位，这一条不是所有磷酸化抗体都过得去。
三条操作建议
刺激时间从 30 分钟起，做 15、30、60 分钟三个点，磷酸化 SMAD 的窗口窄。
WB 上样 20 µg 足够，1/2000 的稀释比不要再加浓，浓了背景会上来。
IHC 修复必须用 pH 9.0 的 EDTA，柠檬酸在这套表位上效果差一截。
下次做双通路，把 BMP4 和 TGF-β1 分两个皿处理，别在同一皿里加。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse |
| 抗原名称 | SMAD3 pS423 + S425 |
| 验证应用 | WB, IHC, IF/ICC, CUT&RUN-seq, Dot |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/100 - 1/250 The secondary antibody is rabbit specific IHC polymer detection kit HRP/DAB ( ab209101 ). Perform heat-mediated antigen retrieval with Tris/EDTA buffer pH 9.0 before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/2000；ICC/IF 1/100 - 1/250；Dot 1/1000 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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