Oct4 的信号进不了核
兔多抗，人鼠两种，39 kDa，含 IP
iPSC 诱导到第十二天，想确认多能性，做 Oct4 的免疫荧光。
细胞核里一片黑，只有边缘有一圈红。
换了通透条件，信号才进去，稀释比一点没改。
Oct4 是转录因子，抗体进不去核，染得再浓也看不到。
核里的信号怎么才进得去
固定之后必须通透，0.2% 到 0.5% 的 Triton X-100 室温十分钟，或者用皂苷。
通透不足的表现很典型：核内空白，胞质或核膜有勾边。
通透过度也不好，核结构会散，信号变成弥散的雾，定位信息就没了。
一抗 4°C 过夜信号最干净，室温两小时也能出，但核内背景会高一档。
通透剂浓度按细胞类型调，iPSC 克隆层厚，Triton 要给到 0.5% 才透得进去。
封闭用含 5% 血清和 0.1% Triton 的 PBS，一抗孵育液里也保留 0.1% Triton。
这支的事实
兔多抗，IgG，无标记，Protein A 亲和纯化，免疫原信息产品页没有公开。
种属是人、小鼠，应用列 WB、ICC/IF、IP 三项，分子量 39 kDa。
规格 100 µg，缓冲液是 PBS 加 1% BSA，pH 7.4，含 0.02% 叠氮钠。
多抗识别多个表位，IP 时拉下的蛋白量通常比单抗多，非特异条带也跟着多。
裂解液里加 1 mM PMSF，Oct4 容易被蛋白酶切，切了就拉不到全长。拉之前留一份 input，后面判断比例才有参照。
没有流式验证，做流式胞内染要自己定条件。
IP 的裂解液选择
Oct4 在核内，IP 前要先做核提取，或者用含 0.5% NP-40 加 0.1% SDS 的裂解液直接裂全细胞。
SDS 浓度高了会破坏抗体结合，超过 0.1% 就要稀释后再加抗体。
拉下来的复合物跑 WB，IgG 重链在 50 kDa 附近，选二抗时用轻链特异性的，避开重链。
Input 一定要留，占总量的十分之一，用来判断拉下来的比例。
洗珠子的缓冲液把盐提到 300 mM，非特异结合会少很多，拉下来的条带干净。
IP 前把抗体和珠子预结合半小时，比先加样本再加珠子拉得干净。
三条操作建议
一抗稀释比产品页没有给，ICC 从 1/200 起，WB 从 1/1000 起。
做 IF 时把 Oct4 和另一个核标记一起染，核定位对不对一目了然。
iPSC 克隆边缘的细胞常自发分化，Oct4 会掉，拍图选克隆中心区域。
下次染的时候同时做一管不加一抗的阴性对照，把曝光参数一次定下来。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse |
| 抗原名称 | POU5F1 |
| 验证应用 | WB, IF/ICC, IP |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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| 品牌 | 货号 | 品名 |
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