Vinculin 不是第二个 actin
兔单抗 [EPR8185]，敲除验证，四类应用
做细胞骨架的粘附斑，想找个内参，顺手拿了 Vinculin。
跑出来 100 多 kDa 附近一条，条带很清楚，就当成上样对照用了。
审稿意见问了一句：Vinculin 本身会随处理变化吗。
会。它是粘附斑的核心组分，细胞铺展状态一变，它的量就变。
粘附斑上的内参跟 actin 不一样
Vinculin 连接整合素和肌动蛋白，细胞贴壁面积、基质硬度、胰酶消化时间都会影响它的表达和分布。
做悬浮细胞或者刚消化下来的细胞，Vinculin 会明显低。
用它做内参，前提是各组细胞的贴壁状态一致。
如果处理本身改变了细胞形态，换 GAPDH 或者总蛋白染色更安全。
一定要用的话，就在同一块胶上同时跑 GAPDH，两个内参的比值比单用一个稳。
Vinculin 的条带在细胞密集时更清楚，铺得稀的样本信号会弱一半。
这支的事实
兔单抗，克隆号 EPR8185，IgG，无标记，Protein A 亲和纯化。
种属是人、小鼠、大鼠，应用列 WB、流式胞内、ICC/IF、IP 四项。
产品页提到特异性在 Vinculin 敲除的 A431 细胞里做过 WB 验证，这是判断脱靶最直接的办法。
缓冲液是 PBS 加 40% 甘油和 0.05% BSA，pH 7.2 到 7.4，含 0.01% 叠氮钠。
分子量产品页没有给，跑胶时按 100 到 120 kDa 的区间去框，别按 actin 的位置找。
做流式时的固定通透
Vinculin 在胞内，流式要做固定加通透，这一步会改变细胞形态，前向散射的图不能再用。
固定用 1% 多聚甲醛，通透用 0.1% Triton，两步之间要充分洗涤。
胞内染色的抗体用量比表面染高，通常加倍。
如果只想看粘附斑的分布，IF 比流式直观得多，流式只适合看总量。
做 IF 时把 Vinculin 和 F-actin 一起染，粘附斑的位置一眼能确认，不用靠形态去猜。
做流式时把碎片门去掉，Vinculin 阳性的碎片会把整体荧光抬高。
三条操作建议
一抗稀释比产品页没有给，WB 从 1/10000 起，Vinculin 在多数细胞里丰度不低。
做 IF 时细胞要长到七成满，太密了粘附斑看不清。
IP 每管用 2 µg 抗体，裂解液用含 1% NP-40 的，别加 SDS。
下次做形态相关的处理，同时跑 Vinculin 和 GAPDH 两个内参，看哪个更稳。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | VCL |
| 验证应用 | WB, FCM, IF/ICC, IP |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
相关产品
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| 品牌 | 货号 | 品名 |
|---|---|---|
| Abcam | Ab129002 | Anti-Vinculin antibody [EPR8185] - Loading Control 本文产品 |
| Abcam | Ab6721 | Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) |
| Abcam | Ab8245 | Anti-GAPDH antibody [6C5] - Loading Control |
| Abcam | Ab15580 | Anti-Ki67 antibody |
参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。