小鼠样本的 Bcl-2，换个克隆就出来了
Anti-Bcl-2 [EPR17509]，WB 1/2000，含胞内流式
小鼠肿瘤模型，取瘤做免疫组化，Bcl-2 染出来几乎看不到东西。
同一批样本换人的阳性对照片，颜色正常，说明试剂和流程都没问题。
把抗体换成另一个克隆，条带和染色一起出来了。
克隆认的是那一段序列
Bcl-2 在不同种属之间的序列有差异，差异集中在柔性环区。单克隆抗体认的是一个小表位，表位上有一两个残基不同，结合就掉了。
E17 那个克隆在人样本上做得好，但产品页写明了 IHC 不推荐大鼠和小鼠。
EPR17509 是同靶点的另一个兔单克隆，产品页标的是人、小鼠两个种属。做小鼠模型，这个差别是决定性的。
选抗体时先看种属那一栏，比看稀释比更重要。
这支抗体的三道门
ab182858 是兔重组单克隆，IgG 亚型，覆盖人和小鼠。产品页标的分子量是 27 千道尔顿，纯化方式是 protein A 亲和纯化，液体剂型。
验证应用三个：WB、IHC-P 和流式胞内染色。
稀释比分开给。WB 1/2000，IHC-P 1/500 配 Tris/EDTA pH 9.0 热修复，流式胞内 1/250。
注意 IHC 的修复液，是 EDTA 不是柠檬酸。Bcl-2 挂在线粒体膜上，表位埋得深，柠檬酸常常揭不开，这一点在另一个克隆上同样成立。
胞内流式这一步
Bcl-2 是胞内蛋白，流式必须固定破膜。表面染色的那套流程套不上。
固定之后先破膜再染，顺序反了信号会明显偏弱。破膜剂的选择也会影响结果，皂苷类温和，适合膜蛋白共染；甲醇类穿透强，但会破坏部分表位。
做双标的时候，Bcl-2 的胞内染色和表面标记要分先后，先染表面再固定破膜，反了表面标记会一起丢。
做凋亡的时候，Bcl-2 常和 Annexin V 一起看。这两个指标的样品处理条件不一样，Annexin V 那部分不能固定，要分两管做。
三条操作建议
IHC 的修复液换成 Tris/EDTA pH 9.0，微波或高压按实验室条件走，别同时改一抗浓度。
WB 从 1/2000 起，这支抗体浓度高，1/1000 容易过曝。阳性对照用已知高表达的组织，扁桃体或淋巴结都行，跟样本同批处理。
流式用 1/250，同型对照按同浓度配。上机前用细胞筛过滤一遍，凋亡晚期的碎片多，不过滤会把碎片算进阳性。
下一批小鼠样本，IHC 那一管直接换 EDTA 修复，一抗留在 1/500。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse |
| 抗原名称 | BCL2 |
| 验证应用 | WB, IHC, FCM |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/500 Perform heat-mediated antigen retrieval with Tris/EDTA buffer pH 9.0 before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/2000；Flow Cyt (Intra) 1/250 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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| 品牌 | 货号 | 品名 |
|---|---|---|
| Abcam | Ab182858 | Anti-Bcl-2 antibody [EPR17509] 本文产品 |
| proteintech | 12789-1-AP | human BCL2 Polyclonal antibody |
| proteintech | 68103-1-Ig | Bcl2 Monoclonal antibody |
| proteintech | 60178-1-Ig | BCL2 Monoclonal antibody |
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