H3K4me1 查的是增强子，不是启动子

Anti-Histone H3 mono methyl K4，ChIP 级多抗

测序回来画热图，H3K4me1 的信号峰落在基因间区，跟启动子对不上。

组会上被问了一句：你确定这个修饰是启动子标记吗。

查了才知道，K4 的单甲基化主要标在增强子上，三甲基化才是启动子。

图 1　细胞免疫荧光 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

三个甲基化状态的分工

同一个赖氨酸残基上，甲基化的数目决定了它招募什么蛋白。

H3K4me3 集中在转录起始位点附近，跟活跃转录相关。H3K4me1 分布在增强子区，标记的是 priming 状态，也就是准备好但未必正在工作的增强子。

在活跃增强子上，H3K4me1 常常和 H3K27ac 共存。只有 me1 没有 ac 的，多认为是静息增强子。

做 ChIP-seq 分析的时候，这两个标记要分开画，不能混着注释。做 CUT&RUN 的话这个区分更重要，原位切割的背景比 ChIP 低，标记之间的差异更容易看出来。

这支抗体的数据

ab8895 是兔多克隆，IgG 亚型，靶点是组蛋白 H3 第四位赖氨酸的单甲基化，种属覆盖人、小鼠、大鼠、牛四个。

验证应用四个：WB、IHC-P、ICC/IF 和 ChIP。产品页标的分子量是 16 千道尔顿，指的是组蛋白 H3 本身，修饰不改变位置。

组蛋白抗体的一个特点是抗原序列短，多抗识别效果通常比单抗稳，代价是批间差异要看每批的 QC 数据。

产品页没有给固定稀释比。组蛋白 ChIP 的抗体量通常比普通转录因子高，需要按每次反应的细胞数来定。

纯化方式是免疫原亲和纯化，液体剂型。

ChIP 的三个对照

input 是必须的，用来归一化不同样品之间的染色质投入量差异。

IgG 对照用来定背景，同型对照比空白珠子更严格。

还有一个常被忽略的：总 H3 抗体。组蛋白修饰的 ChIP 结果，最终要除以总 H3 的信号，否则核小体密度变化会被误读成修饰水平变化。

没有这一层归一，处理组和对照组之间的差异很难解释。做 qPCR 验证时，引物要落在增强子中心，不要落在旁边的启动子上。

三条操作建议

染色质片段压在几百碱基对，核小体间隔大约一百多碱基，片段太大就分不清相邻的核小体。

交联时间也要固定。甲醛交联过久，核小体之间的连接变硬，超声打不开；时间太短，蛋白留不住。

抗体量按细胞数走，细胞数翻倍，抗体也要跟着加。细胞数在一百万到几百万之间时线性范围还在，超过这个量级要重新摸条件。

下一批 ChIP，先补一支总 H3 抗体做归一。

关键参数

图 2　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

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