1/50000 的稀释比，敢不敢用
Anti-p62 [EPR4844]，WB 一万倍起
按常规习惯配了一管一抗，1/1000。膜放进去孵育过夜，第二天显影，整张膜全黑，连分子量标记的泳道都有信号。
不是抗体脏，是这支的用量该往下压一个数量级。
稀释比一万倍起，三个系统三个数
产品页给 WB 的稀释比是 1/10000 到 1/50000。
这个区间在抗体里算少见。原因和克隆有关，EPR4844 是兔单抗，用专利的兔杂交瘤技术做的，批次的效价稳定，浓度也高。
按这个比例配，一支能用很久。算一下，1 mL 孵育液里加 0.02 到 0.1 µL 抗体，普通移液器根本吸不准。
实际操作要两步稀释。先配 1/100 的中间液，再从中间液取 1/100 到 1/500。中间液当天用完，不要留到第二天。
p62 会跟着自噬流一起变
p62 也叫 SQSTM1，是个接头蛋白，把待降解的货物送到自噬体，自己也被一起降解。
所以 p62 升高有两种完全相反的原因。一种是自噬被阻断，蛋白堆起来；一种是自噬被激活，转录上调补偿。单看一个时间点的条带，区分不了。
要做自噬流，加一组氯喹或者巴弗洛霉素。阻断之后如果 p62 继续升高，说明流是通的。阻断之后没变化，流本身就卡住了。
溶血磷脂酰胆碱之类的溶酶体抑制剂也能用，原理一样，压的都是降解那一步。
样本里的 p62 不一定进得去上清
p62 在聚集态下会往不溶相走。用温和的 RIPA 裂解，离心后的沉淀里常常残留相当一部分。
上清跑出来的条带偏弱，不代表样本里 p62 少。做这类样本，裂解液里加 1% SDS，或者上样前用尿素体系溶解沉淀，回收率会好很多。
上样缓冲液里 SDS 的量也要够。p62 容易聚成高分子量复合物，SDS 不足时会在浓缩胶界面卡住，显出拖尾。
ICC/IF 给的是 1 µg/mL，是浓度不是比例。配的时候按体积算，96 孔板和小圆片用量差很多。
流式胞内是 1/10 到 1/100，跨度十倍。破膜后的样本非特异吸附多，从 1/100 试起，背景压不住再往上加。
同型对照产品页点名了 ab172730，兔单抗 IgG，和这支配着用。
三条操作建议
缓冲液含 40% 甘油和 0.05% BSA，负二十度存放，稳定期十二个月。取用前离心几秒，把管壁上的液体甩下来再开盖。
配中间液用低吸附管。1/100 的液体里抗体量极少，普通管壁的吸附就可能带走可观的比例。
显影从短曝光开始。这支信号强，先曝五秒，不够再叠，别一上来就压三分钟。
明天配液之前，先在记录本上写下 1/10000 这个数，把 1/1000 的习惯收起来。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | SQSTM1 |
| 验证应用 | WB, FCM, IF/ICC, IP |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | WB 1/10000 - 1/50000；ICC/IF 1 µg/mL；Flow Cyt (Intra) 1/10 - 1/100 ab172730 - Rabbit monoclonal IgG, is suitable for use as an isotype control with this antibody. |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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参数与产品价格以生知库产品页实时信息为准。文中实验图片取自厂家官网产品页，仅用于说明该抗体的验证情况。