判凋亡，别只盯 35 kDa 那条
Caspase 3 多抗，识别全长与剪切体
药物处理四十八小时，收样跑胶。Caspase 3 的位置有一条很粗的带，和对照比还亮了一些。学生说凋亡被抑制了。
这条带在 35 kDa。凋亡真正发生的标志，在这个位置下面。
全长是前体，剪切才有活性
Caspase 3 在细胞里以无活性的前体形式存在，分子量 35 kDa 左右。
凋亡信号传下来，上游的起始 caspase 在特定位点切开它，产生 17 kDa 和 19 kDa 两个片段，这两个片段组成有活性的异二聚体，再去切下游底物。
产品名里的 P17 和 P19 指的就是这两个片段，这支抗体同时识别全长和剪切体。所以一张膜上出现两三条带是正常的。
只看 35 kDa 那条的深浅，判断不了凋亡有没有发生。处理之后全长条带反而变强，可能是转录上调，也可能是降解受阻，单独拿出来讲不成立。
判读顺序，先看小分子量再看大分子量
跑胶之后，先把 17 和 19 kDa 的位置看清楚。这两条带出现了，才说明剪切发生了。
再看 35 kDa 那条有没有相应减弱。减弱说明前体在被消耗，和剪切片段同时出现，结论才站得住。
两个都对不上的时候，往下游走一步。PARP 是 caspase 3 的经典底物，剪切后产生 89 kDa 的片段，这条带比 caspase 3 本身更稳定，不容易被降解掉。
样本处理与其他几项应用
剪切体出现的时间窗很窄。处理太久，细胞已经碎完，剪切片段跟着降解，胶上反而看不出来。
常见的时间点是四到二十四小时之间取几个时点。每个时点单独一管，不要合在一起跑。
裂解液里加广谱蛋白酶抑制剂是必需的。剪切片段比前体更容易被降解，抑制剂加晚了一步，条带就淡了。
上样量按总蛋白算。凋亡后期总蛋白会下降，按等体积上样，条带变淡可能只是细胞少了。
应用栏里有 WB、IHC、ELISA、IF/ICC、IF-P、IP，覆盖得比较全。
IF-P 是石蜡切片的免疫荧光。做组织里的凋亡检测，这一项比 WB 更直观，能看出阳性细胞在哪一层。
ELISA 用这支的时候要留意，多抗识别多个表位，夹心法里的配对需要另外验证，不能随便搭配。
IP 拉 caspase 3，拉下来的是前体和剪切体的混合。要看相互作用，跑胶的时候用 15% 的胶把两种分开。
反应种属是人、小鼠、大鼠。纯化方式是抗原亲和纯化，缓冲液里含 50% 甘油，负二十度存放，一年内稳定，不必分装。
三条操作建议
配 15% 的胶。17 kDa 和 19 kDa 只差两 kDa，浓度低了分不开，看起来是一条带。
转膜用 0.22 µm 的膜，湿转，恒流两百毫安，六十分钟。小分子量蛋白容易穿膜，时间长了信号丢在滤纸里。
显影的时候不要裁膜。裁掉上半部分只留小分子量区，就看不到全长条带，判断依据少一半。
下次看结果，先把 17 kDa 那一条找出来，再回头说全长的变化。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | Caspase 3 |
| 验证应用 | WB, IHC, ELISA, IF/ICC, IF-P, IP |
| 偶联标记 | Unconjugated |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Antigen affinity purification |
| 储存条件 | Store at -20°C. Stable for one year after shipment. Aliquoti |
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