BDNF 的修复温度，别到沸点
BDNF 兔单抗，IHC-P 1/500，先 98 度
海马切片做 BDNF，齿状回颗粒层下面一片背景，阳性细胞的轮廓看不太出来。学生说抗体浓度低了，想加到 1/200。
BDNF 是分泌型的神经营养因子，合成后走分泌途径释放出去。组织里的存量本来就低，固定不及时，剩的更少。
浓度不是主要矛盾。样本处理才是。
分泌蛋白留不住
灌流固定这一步决定成败。先 PBS 冲血，再上 4% PFA。冲不干净，血红蛋白的过氧化物酶活性会在显色时变成背景。
取脑后后固定两小时，不要过夜。时间长了抗原决定簇被交联遮住，热修复也救不回来。
蔗糖沉底到组织下沉，然后冻。冻的时候别直接扔负八十，用异戊烷加干冰，慢冻会形成冰晶。
冰晶一多，切片上就是一个个空洞，阳性的胞体被撕开，计数时会被当成阴性。切片厚度也要统一，四十微米和二十微米看到的细胞数不一样。
这支的事实
克隆号 EPR1292，兔单抗，IgG。反应种属人、小鼠、大鼠。
应用四项，WB、IHC、FCM、IF/ICC。IHC-P 1/500，说明书给了一个具体条件，加热到 98 度以下、不沸腾，然后冷却十到二十分钟。IHC-Fr 1/100，柠檬酸缓冲液热修复。
WB 1/1000，ICC/IF 1/500，流式胞内 1/30。
那个温度细节值得照做
98 度以下，不沸腾。这个说法在别的说明书里少见，但道理清楚。
沸腾会让切片脱落，也会让组织形态变形。BDNF 的阳性信号本来就弱，形态一散，计数就没法做。
用微波炉，中火间歇加热，每次一分钟，拿出来补液。用高压锅要等自然降压，不要手动放气。
冷却这一步也别省。从九十多度直接进室温水，切片容易翘，神经元的形态会缩。
建议
一抗四度过夜，比室温两小时稳。切片上的孵育体积小，盖上盖玻片防止干片。
判读先看胞质和突起。BDNF 在神经元里分布到轴突和树突，胞体强信号加上突起染色才算阳性，只有胞质一片糊的要谨慎。
海马不同区的表达差异大，计数时分区分开算，齿状回、CA1、CA3 各算各的。
做冰冻切片用 1/100，比石蜡的 1/500 浓五倍。两套片子不能共用一管工作液。
灌流压力别太大，成年小鼠一百毫米汞柱上下，压力高了血管破裂，组织里渗进红细胞。抗体稀释液用含 1% BSA 和 0.3% Triton 的 PBS，脑组织脂质多，去垢剂少了渗不进去。
下次做 BDNF，把后固定压到两小时，别过夜。
关键参数
| 反应种属 | Human, Mouse, Rat |
| 抗原名称 | BDNF |
| 验证应用 | WB, IHC, FCM, IF/ICC |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Protein A |
| 推荐稀释 | IHC-P 1/500 Heat up to 98 degrees C, below boiling, and then let cool for 10-20 min. Perform heat-mediated antigen retrieval before commencing with IHC staining protocol.；WB 1/1000；ICC/IF 1/500；Flow Cyt (Intra) 1/30 |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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| 品牌 | 货号 | 品名 |
|---|---|---|
| Abcam | Ab108319 | Anti-BDNF antibody [EPR1292] 本文产品 |
| Abcam | Ab6721 | Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) |
| Abcam | Ab8245 | Anti-GAPDH antibody [6C5] - Loading Control |
| Abcam | Ab15580 | Anti-Ki67 antibody |
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