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NLRP3 不刺激就是看不见

NLRP3 兔单抗，WB 1/1000

Abcam · 货号 Ab263899

NLRP3 不刺激就是看不见

THP-1 用 PMA 分化过夜，第二天直接裂解收蛋白。跑 NLRP3，那条带淡得几乎看不见。

同一批细胞另设一组，LPS 预处理四小时再加 ATP 半小时，条带出来了，而且不止一条。

第一组不是失败，是没给诱导条件。NLRP3 在静息细胞里表达很低，这是它的正常状态。

图 1　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）

它需要两步信号

NLRP3 炎症小体的激活要两道信号。第一道来自 TLR 配体，比如 LPS，把 NF-κB 推上去，NLRP3 的转录和蛋白量跟着涨。

第二道是钾外流、溶酶体破裂一类的刺激，ATP 就是常用的一种。这一步让炎症小体组装，caspase-1 活化。

只给第二道信号，蛋白量不够，组不起来。只给第一道，蛋白有了但不激活，也看不到下游。

做 WB 只需要第一道就够看条带，做功能实验两道都要给。

两步之间还有一层调控。NLRP3 的蛋白量受泛素化降解控制，阻断蛋白酶体也能让它在 WB 上变多，这时候看到的不是激活。

克隆号 EPR23094-1，兔单抗，IgG。反应种属写了人、小鼠、大鼠三个。

应用列了四项，WB、ELISA、FCM、IP。这四个都是检测蛋白量或者拉蛋白的，没有做原位染色。

稀释分别是 WB 1/1000，胞内流式 1/50，IP 1/30。三个数字都写在产品页上，不用自己摸。

说明书里写了两句要紧的话。第一句，多数样本需要刺激才能检测到 NLRP3。第二句，不同异构体和翻译后修饰会让 WB 出现多条带。

所以跑出两条甚至三条，不要第一反应是抗体不纯。先看阳性对照有没有同样的图样，有就说明是目标蛋白本身的特征。

判读的时候认那条跟阳性对照一致的主带，其他带当作背景说明写进记录。

如果主带位置跟阳性对不上，那才是问题，先怀疑裂解条件和降解。

判读前先看阳性对照的图样。对照泳道有几条带，样本就该有几条，多出来的才需要解释。

WB 从 1/1000 起，不要往更浓调。NLRP3 的问题从来不是信号弱，是背景杂。

做胞内流式，1/50 这个浓度偏高。细胞数压到每管五十万，染色体积一百微升，否则背景会盖住阳性群。

IP 用 1/30，拉之前先做一次预清除，用同种属的普通 IgG 加珠子预孵育半小时，非特异能降下来。

裂解液用温和一点的，RIPA 可以，别加 SDS。炎症小体是大分子复合物，强变性剂会把结构拆散。

下次做诱导，把 LPS 和 ATP 两个时间点各设一管单独收，看哪一步带来的条带变化最大。

反应种属	Human, Mouse, Rat
抗原名称	Nlrp3
验证应用	WB, ELISA, FCM, IP
宿主/亚型	Rabbit / IgG
抗体类型	Monoclonal
纯化方式	Affinity purification Protein A
推荐稀释	WB 1/1000 Stimulation may be required to allow detection of the NLRP3 protein in most samples. There may be multiple bands of NLRP3 in WB assay due to different isoforms and PTMs.；Flow Cyt (Intra) 1/50；IP 1/30
储存条件	短期 +4°C；长期 -20°C

图 2　Western blot 验证结果（图源：Abcam 官网产品页）