软骨切片，脱钙液先换成 EDTA
Anti-Collagen II，兔多抗，IHC 与 dot blot
关节软骨的片子，切片的时候还挺完整，染完一看，表层卷起来了，阳性也淡。
同学的第一反应是修复不够，把微波时间从 10 分钟加到 20 分钟。
片子更碎了，染色没变好。
问题在脱钙。
强酸脱钙会吃掉抗原
骨和软骨样本要脱钙才能切片。常用的强酸脱钙液速度快，但对蛋白抗原不客气，长时间浸泡会把表位水解掉。
EDTA 是螯合剂，靠抓钙离子起作用，pH 中性，对抗原温和。代价是慢，一周到几周不等。
判断脱钙到位没有，用针扎一下，能轻松穿透就差不多了。泡过头同样会伤抗原。
脱钙之后的冲洗要做够，残留的酸会带进后面的修复步骤。
小鼠的膝关节，四周龄样本通常两三周脱完，成年样本要更久。换液勤一点，比一次泡很久稳妥。
抗原修复和脱钙是两件事
修复是揭开甲醛交联形成的遮蔽，脱钙是去掉矿物质。两个问题各有各的解法，用延长修复去补脱钙的损失，往往只是把组织煮烂。
柠檬酸和 Tris/EDTA 两种修复液都可以试，同一块组织切两张，一次比出来。
软骨的细胞外基质致密，抗体穿透本来就慢，孵育时间可以比常规延长，温度还是四度过夜，不要图快改室温。
切片厚度对软骨尤其重要，三微米太薄容易碎，五微米更好操作。
这支抗体的两个系统
靶点是 COL2A1，II 型胶原，透明软骨的主要成分。
反应种属只有人源和牛源。做小鼠、大鼠的骨关节炎模型，这支不在范围内，要另找。
验证系统是 IHC-P 和 Dot blot。Dot blot 用在可溶性胶原的定性上，把样品点在膜上，不跑电泳。蛋白不用跑开，抗体的特异性就变成唯一变量，做批间比较反而直观。
多克隆，兔宿主，产品页没给固定稀释比。没有固定值的时候，用同一块组织做三个梯度，选背景最低的那一档写进记录。
判读的位置感
II 型胶原染的是基质，不是细胞。阳性是一片网状的棕色，细胞所在的地方反而是空的小窝。
关节软骨分表层、中间层、深层，各层的纤维走向不同，染色的深浅本来就有差别。
拍图的时候把软骨的全层放进同一个视野，从表层到钙化层一起看，只截表层一张图，结论很容易偏。
骨关节炎模型里，表层最先丢失阳性，这个顺序比整体深浅更有意义。
背景重的时候，先看软骨陷窝里是不是干净，那里干净说明抗体没有乱贴。
下一批样本，脱钙液换成中性 EDTA，每三天换一次液，脱到位再切片，修复条件先按柠檬酸跑一张对照。
关键参数
| 反应种属 | Human, Bovine |
| 抗原名称 | COL2A1 |
| 验证应用 | IHC, Dot |
| 宿主/亚型 | Rabbit / IgG |
| 抗体类型 | Polyclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification Immunogen |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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