H3K9me2 有交叉，先做肽段
Anti-H3K9me2 [mAbcam 1220]，小鼠 IgG2a
组蛋白修饰的抗体，最怕的不是染不出来，是染错了地方。
同学做 H3K9me2 的 ChIP，qPCR 跑出来一串位点，富集都在三倍以上，看着很漂亮。
导师问了一句，做过肽段竞争没有。
他把产品页翻到最后，才看到那行关于交叉反应的提示。
产品页自己写了交叉
Dot blot 那一栏写着，这支抗体在肽段点杂交里和 H3R8me2 有一定交叉，需要进一步优化才能把交叉压下去。
这句话不是免责声明，是操作提示。
组蛋白的 N 端尾巴上，修饰位点挨得很近，K9 和 R8 只隔一个残基。抗体识别的表位如果覆盖到相邻残基，交叉就发生了。
做这类修饰的定量，肽段 dot blot 是绕不过去的一步。
交叉怎么排除
最直接的办法是做肽段竞争。把修饰肽和未修饰肽分别预孵育抗体，再上膜或上切片。
信号被修饰肽抢走，说明认的是这个修饰；被非修饰肽也抢走一部分，交叉就成立。
H3R8me2 的肽段单独做一组，看它在什么浓度下开始压信号。
ChIP 之后再加一步，用两三个已知位点验证，阴性位点必须真的阴性。
阴性位点选错了，假阳性会被当成真信号。常用的做法是选一段已知活跃转录的基因启动子，H3K9me2 在那里本来就低。
这支抗体的条件
靶点是 H3 的 K9 双甲基化。宿主是小鼠，亚型 IgG2a，单克隆。
反应种属写得很宽，人、牛、拟南芥、果蝇、水稻都在列。组蛋白的序列高度保守，跨物种能用是这个原因。
ChIP 用量是 2 到 4 µg 对 25 µg 染色质，阳性对照引物用 ab269259。
WB 1 到 5 µg/mL，ICC/IF 5 µg/mL，ELISA 0.00025 到 1 µg/mL，dot blot 1/1000。
用量比想象中少
25 µg 染色质配 2 到 4 µg 抗体，一次 ChIP 用掉的抗体量很小。
量小的原因在效价，不在亲和力。效价高的抗体，同样的富集用更少的量就能做到。
别因为这个数小就往下压。压到 1 µg 以下，富集曲线会掉得很快，而且掉得不线性。
做三个用量点，2、3、4 µg，同一份染色质，看富集是不是跟着线性走。线性说明还在范围里，不线性说明已经过了拐点。
ELISA 那一栏的区间跨度极大，从 0.00025 到 1 µg/mL，做标准曲线的时候从低浓度往上爬。
明天先做两件事：一支 H3K9me2 肽、一支 H3R8me2 肽，各点三个浓度做竞争；ChIP 按 3 µg 起，阳性引物和两个阴性位点一起跑。
关键参数
| 反应种属 | Human, Arabidopsis, Bovine, Drosophila, Oryza sativa |
| 抗原名称 | H3C1 di methyl K9 |
| 验证应用 | WB, IHC, ELISA, IF/ICC, ChIP, Dot |
| 宿主/亚型 | Mouse / IgG2a |
| 抗体类型 | Monoclonal |
| 纯化方式 | Affinity purification |
| 推荐稀释 | WB 1-5 µg/mL；ICC/IF 5 µg/mL；ChIP 2-4 µg for 25 µg chromatin Use AFM ChIP primer pair ab269259 as positive control.；ELISA 0.00025-1 µg/mL when testing with immunogen peptide. |
| 储存条件 | 短期 +4°C；长期 -20°C |
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